Nature:线粒体内膜的暴露引发细胞凋亡线粒体自噬

“线粒体内膜的暴露引发细胞凋亡线粒体自噬”的研究论文于2024 年 2 月 23 日在Nature在线发表。

在内源性途径引导的细胞凋亡过程中，BAX/BAK激活了线粒体的透化，导致细胞色素c释放。接着，线粒体网络发生剧烈的重塑，导致线粒体膨胀并释放促炎线粒体成分。

研究发现，在这一过程中，线粒体膨胀并暴露出线粒体内膜（IMM），触发了一种特殊形式的线粒体自噬，将这些受损的细胞器传递到溶酶体。这种IMM诱导的线粒体自噬与典型的PINK1/Parkin信号传导独立发生，并受到IMM的泛素化驱动。

研究数据表明，IMM诱导的线粒体自噬是细胞另一个安全机制，可以用来抑制受损的线粒体。在Caspase激活不完全或受抑制的情况下，以及PINK1/Parkin线粒体自噬功能受损或不足的情况下，这种机制可能具有特别重要性。

01介绍

线粒体是膜结合细胞器，对于所有真核生物的 ATP 生产至关重要。自从十亿多年前与较大的宿主细胞建立了关键的内共生关系以来，线粒体已成为细胞信号传导的枢纽。健康的线粒体网络是通过生物发生（新线粒体的形成）、动力学（裂变和融合）、线粒体修复（例如线粒体未折叠蛋白反应）和线粒体降解途径（包括但不限于线粒体自噬）之间的协调平衡来维持的。），统称为线粒体质量控制。这种质量控制很重要，不仅对于维持健康、功能性的线粒体网络 ，而且对于防止与分子模式 (DAMP) 信号传导相关的不必要的损伤。无法修复的受损线粒体将被自噬清除。

自噬过程可分为五个主要步骤：（1）起始，（2）成核，（3）延伸，（4）货物封存和完成，以及（5）溶酶体融合。启动时，自噬体形成始于 ULK1 复合物（由 ULK1 和 ULK2、ATG13、ATG101 和 FIP200 组成），然后通过磷酸化 PI3K-Beclin1 复合物（由 III 类 PI3K、 VPS34、p115、Beclin-1、ATG14 和 AMBRA1）。ATG12-ATG5-ATG16L1 复合物随后在吞噬细胞伸长中发挥作用。接下来，ATG8（包括 LC3）经过 ATG4、ATG3、ATG7 和 ATG5 复合物的修饰，导致与磷脂酰乙醇胺共价连接，形成 LC3-II。LC3 通常用作自噬体的标记物，其功能是塑造不断生长的吞噬细胞 并参与货物招募 。然后，不断生长的吞噬泡包围内容物，形成完整的自噬体，然后与溶酶体（一种含有降解酶的低 pH 细胞器）融合。自噬可以针对特定的细胞器，就线粒体而言，被称为线粒体自噬。

有多种线粒体自噬途径参与一系列生理和病理环境——无论是由于线粒体损伤而去除线粒体，还是在特殊细胞或组织的发育过程中。这些线粒体自噬途径可大致分为两类：泛素依赖性和泛素非依赖性。最典型的线粒体自噬形式是由 PINK1 和 Parkin 控制的。Parkin 是一种 E3 连接酶，当 PINK1 在线粒体外膜 (OMM) 上稳定后，它会转位至受损的线粒体 。在那里，Parkin 泛素化 OMM 蛋白，从而标记受损的线粒体，供自噬体封装，然后输送至溶酶体。PINK1 和 Parkin 在早发性帕金森病 (PD) 中均发生突变 ，凸显了线粒体质量控制在神经元健康中的重要性。

与细菌起源一致，线粒体含有许多分子，如果线粒体损伤时释放这些分子，这些分子可以充当促炎性 DAMP。一个例子是线粒体 DNA (mtDNA)，它激活 DNA 传感器 cGAS，然后启动 STING 信号级联反应。大量研究表明，错误定位的 mtDNA 可能与多种免疫相关疾病有关，包括系统性红斑狼疮、脓毒症、肝衰竭、艾滋病毒、心肌梗死、中风、癌症和类风湿性关节炎，以及无细胞循环增加据报道，PD 患者的 mtDNA 携带PINK1或PRKN突变，进一步表明线粒体自噬对多种炎症病理的重要性。

最近有报道称，线粒体 DAMP 释放（包括 mtDNA 释放）发生在细胞凋亡过程中，但尽管如此，细胞凋亡却以免疫沉默的方式发生。在这种形式的程序性细胞死亡中，促死亡蛋白 BAX 和 BAK 使 OMM 通透，从而释放细胞色素 - c，然后激活凋亡 caspase 级联 。然后 BAX 和 BAK 进一步寡聚，在 OMM 中形成弧形和大孔，线粒体内膜 (IMM) 通过弧形和大孔突出到细胞质中 并变得可渗透，从而释放 mtDNA 等基质成分 。如果 caspase 级联被激活，凋亡细胞的快速破坏会阻止响应细胞质 mtDNA 产生细胞因子，然而，凋亡 caspase 的遗传或药理学抑制会触发 mtDNA 诱导的 DAMP 信号传导。目前尚不清楚线粒体质量控制机制是否参与这两种情况，如果是的话，这些途径是如何启动和调节的。

此论文研究发现，在内源性细胞凋亡过程中，突出的线粒体被自噬体隔离，并被输送到低 pH 环境（可能是溶酶体）进行降解。该过程的发生不依赖于最具代表性的线粒体自噬调节剂 PINK1 和 Parkin，但依赖于 IMM 的泛素化。如果没有 IMM 泛素化，突出的线粒体向溶酶体的传递就会受到损害，这表明 IMM 诱导的线粒体自噬对于去除受损的线粒体和潜在的 DAMP 可能很重要，因为凋亡 caspase 功能或经典线粒体自噬机制已受到损害。

02相关过程图片

图 1：线粒体自噬发生在细胞凋亡过程中

图 2：细胞凋亡过程中线粒体自噬的发生独立于 PINK1/Parkin 线粒体自噬和 STING 诱导的自噬。

图 3：细胞凋亡过程中的线粒体自噬利用了典型的自噬体形成机制。

图 4：自噬衔接蛋白 P62、OPTN 和 NDP52 被募集到突出的线粒体中。

图 5：突出的线粒体内膜被泛素化，并作为吞噬自噬体形成的位点。

图 6：线粒体内膜的泛素对于细胞凋亡线粒体自噬至关重要。

03结果

突出的线粒体是细胞凋亡过程中降解的目标。为了检查内在细胞凋亡过程中是否发生线粒体自噬反应，研究者们利用了BH3模拟物ABT-737处理的Mcl1?/?小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），ABT-737会诱导这些细胞中快速发生的BAX/BAK依赖性死亡。实验分别在存在或不存在泛半胱天冬酶抑制剂QVD-OPh的情况下进行（图1A）。

首先，在处理后的4小时和8小时内，通过免疫印迹分析细胞裂解物。研究者观察到，单独使用ABT-737或与QVD-OPh组合使用时，LC3B的脂质化明显增加，表现为较低的LC3-II条带（图1B）。在Bax?/?Bak?/?Mcl1?/?MEF中，这种增加现象不存在，但这些细胞对于FCCP诱导的线粒体自噬反应正常，表现出明显的LC3B脂质化（图S1A、B）。

然后，研究者通过对Mcl1?/?MEF表达GFP标记的LC3B、TOMM20-Halo和TFAM-mScarlet进行活细胞成像，检查LC3B的聚集情况。载体处理的细胞（即DMSO）表现出弥散的细胞质GFP-LC3B信号（图1C），而ABT-737/QVD-OPh处理导致GFP-LC3B斑点形成显著增加（图1C、D）。在这些GFP-LC3B斑点中，大多数与线粒体相关（图1E）。处理后，与线粒体无关的GFP-LC3B斑点有小幅但不显著的增加（图1F）。处理后4小时，细胞显示出与GFP-LC3B相关的线粒体比例约为10％，其中一些细胞显示出高达40％的与LC3B斑点相关的线粒体体积（图1G）。

接下来，研究者利用转盘显微镜检查了这些事件的动力学（电影1）。第一个与线粒体相关的LC3B点在疝出后约20分钟出现。约15分钟后，形成完全包裹突出线粒体的透明GFP-LC3B囊泡（图S1C）。为了更高通量地进一步监测线粒体突出过程中的线粒体自噬，研究者生成了表达线粒体靶向mtKeima的细胞，mtKeima是一种根据环境pH值在不同激发波长下发出荧光的蛋白质，其荧光强度取决于其环境pH值。在溶酶体的低pH环境中荧光是可区分的[17]（图1H）。与研究者们的LC3B数据一致，用ABT-737处理Mcl1?/?mtKeima MEF，无论有无QVD-OPh，都会诱导线粒体递送至低pH环境（图1I）。这种反应依赖于BAX和BAK，因为在Bax?/?Bak?/?Mcl1?/?MEF中mtKeima位移被消除（图S1D、E），并且并不表明线粒体自噬能力丧失，因为Bax?/?Bak?/?Mcl1?/?MEF在DFP处理后仍能启动线粒体自噬（图S1F、G）。

综上所述，这些数据表明，在细胞凋亡过程中，突出的线粒体被隔离在溶酶体的低pH环境中。